Leggere il DNA, il sequenziamento del DNA

Se il genetista vuole leggere un gene deve, per prima cosa, copiarlo. All’inizio si procede allo stesso modo che per la replicazione del DNA, il cui funzionamento ti è stato spiegato nel capitolo precedente.

Per il sequenziamento del DNA c’è bisogno di:

  • Copie del gene da leggere:
  • Primers, i corti frammenti di DNA a singolo filamento identici all’inizio  del gene d’interesse. In questo caso sono marcati con una determinata sostanza.
  • Un duplicatore di DNA, la DNA polimerasi.
  • Un elevata quantità dei quattro componenti del DNA: A, T, G e C.

Il genetista ripartisce tutto quanto in quattro provette, etichettate come A, T, G e C. Poi aggiunge in ciascuna provetta un elemento che compone il DNA con uno “stopper”: nella prima provetta A-STOP, nella seconda T-STOP, nella terza G-STOP e nella quarta C-STOP.

Quando la DNA polimerasi aggiunge un componente-STOP, la replicazione viene bloccata.

Sono prodotti dei frammenti di DNA di lunghezza differente

Come durante un processo di replicazione normale (reazione a catena della polimerasi), le quattro provette sono poste in un apparecchio nel quale è possibile regolare la temperatura automaticamente.

  • A 94°C, i due filamenti di DNA si separano.
  • A 60°C, i primers corrispondenti si fissano sul DNA.
  • A 72°C, la DNA polimerasi aggiunge uno dopo l’altro gli elementi che compongono il DNA.

A differenza di un processo di replicazione normale, ad un certo punto un componente-STOP viene aggiunto nella copia di DNA. Ogni volta che questo succede la riproduzione si interrompe. In questo modo si troveranno nella provetta A dei frammenti di DNA di lunghezza differente, ma che terminano tutti con una A-STOP. Lo stesso accade per le altre provette.

Separare i frammenti di DNA secondo la loro lunghezza

I frammenti di DNA sono separati secondo la loro lunghezza per elettroforesi su gel (capitolo: tagliare il DNA in pezzi). Il contenuto della provetta A è caricato sulla prima corsia del gel, e poi di seguito sono caricati gli altri sulle 3 corsie seguenti.

Una volta che l’elettroforesi è terminata, il genetista può produrre una specie di film radiografico grazie ai primers marcati. A livello della corsia della provetta A si trovano i frammenti di DNA di lunghezza differente, che terminano con la lettera A. lo stesso vale per le altre 3 corsie.

Il genetista può quindi leggere il gel. Per fare questo si inizia dal basso. Se il più piccolo frammento di DNA proviene dalla corsia della provetta C si annota una C. Se, poi, il secondo frammento di DNA più corto proviene dalla corsia della provetta G, si annota si seguito un G e così via finché tutte le lettere del gene d’interesse sono state lette.

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